Uma visão mais detalhada da faixa dinâmica e da relação sinal-ruído em espectrofotómetros

A espectroscopia é uma técnica complexa, com muitas variações e nuances a serem consideradas, muitas vezes enquadradas em terminologias e especificações que não são familiares aos utilizadores ou que podem ser interpretadas de maneiras diferentes.
Além disso, geralmente, os utilizadores têm necessidades de medição muito distintas – por exemplo, tão diferentes quanto caracterizar um feixe de laser ou medir a fluorescência de corantes biológicos – que determinam a relevância de cada critério.

Dentro desse contexto, focaremos esta nota técnica nas definições práticas de faixa dinâmica e da relação sinal-ruído (SNR), que são especificações comuns em espectrofotómetros, e avaliaremos a importância de cada um na avaliação do desempenho do espectrofotómetro.

Na espectroscopia, a faixa dinâmica é a relação entre as intensidades de sinal máximo e mínimo que um espectrofotómetro pode detetar. Mais especificamente, a faixa dinâmica é o sinal detectável máximo (ou seja, próximo à saturação) dividido pelo sinal detectável mínimo. O sinal detectável mínimo é definido como o sinal com uma média igual ao ruído da linha de base (ou seja, o ruído da leitura do detector, componentes eletrônicos e assim por diante).

Porque é que a faixa dinâmica é relevante? Para espectroscopia, a faixa dinâmica dá uma ideia de quanto espaço na escala está disponível para detetar recursos espectrais numa única leitura. Em suma, uma alta faixa dinâmica permite que se vejam tanto os picos “pequenos” (ou seja, mais baixos no eixo y, próximo à linha de base) como os picos altos (ou seja, em direção ao topo do eixo y) de forma clara dentro da mesma medição. Com uma faixa dinâmica mais baixa, os picos mais pequenos seriam impossíveis de diferenciar devido ao ruído em redor da linha da base.

Se pensarmos na faixa dinâmica em termos de som, uma pessoa saudável com boa audição tem um sistema auditivo com uma faixa dinâmica suficiente para ouvir algo tão suave como um sussurro e tão alto como um motor a jato.

Para os espectrofotómetros da Ocean Optics, relatamos a faixa dinâmica em termos de uma única aquisição, que é definida como o menor tempo de integração que fornece a faixa dinâmica mais alta possível. A especificação da faixa dinâmica de todo o sistema é definida como a relação entre o sinal máximo e o mínimo no tempo de integração mais longo e a relação entre o tempo máximo e o mínimo de integração:

DRsingle acquisition = número de contagens na saturação/ruído de linha de base em menor tempo de integração

DRsys = (número de contagens na saturação/ruído de linha de base na integração mais longa) x (tempo de integração mais longo/tempo de integração mais curto)

Aqui é onde as coisas ficam um pouco complicadas. Embora a faixa dinâmica seja, geralmente, referente a uma única leitura, é possível aumentar a faixa dinâmica calculando a média de várias leituras. Mas isso não é muito prático, pois a faixa dinâmica não inclui fatores de ruído relacionados com a profundidade do poço do detector (corrente escura) e com o ruído de disparo (flutuações no número de fótons detectados).

Na nossa experiência, os utilizadores combinam, por vezes, faixa dinâmica e sensibilidade do espectrofotómetro, que é a quantidade mínima de luz que pode ser detectada num tempo de integração fixo para uma determinada configuração do espectrofotómetro.
Embora a faixa dinâmica e a sensibilidade estejam relacionadas, não são sinónimos. De fato, a sensibilidade é afetada por muitos fatores e é um tópico para um documento técnico separado.

SNR e faixa dinâmica cobrem territórios semelhantes, mas são parâmetros diferentes. O SNR é, normalmente, definido como a intensidade máxima do sinal dividida pela intensidade do ruído num determinado nível de sinal, o que significa que pode mudar de medição para medição. Aqui está outra maneira de pensar: se a faixa dinâmica é o sinal máximo dividido pelo ruído, SNR é o sinal máximo dividido pelo ruído na saturação.

Algumas pessoas podem não perceber que o ruído aumenta em função do sinal, ou seja, o próprio sinal começa a adicionar ruído ao sistema. Como esse ruído aumenta em função do sinal devido ao ruído do fóton, a função SNR é um gráfico de valores individuais de SNR versus o sinal em que foram obtidos. Normalmente, os fabricantes definem a especificação SNR como o sinal máximo dividido pelo ruído no tempo mínimo de integração para uma única leitura (ver mais à frente).

Frequentemente, o teste de SNR é realizado com uma fonte de luz de banda larga, de modo que o pico espectral quase fique saturado no menor tempo de integração do detetor ou num tempo de integração bem abaixo do limite de ruído térmico (o espectro também deve ter uma área de contagem baixa ou quase zero). O SNR é calculado fazendo X leituras sem luz (usamos 100 leituras) e calculando o valor médio da contagem da linha de base em cada pixel, e depois fazendo X leituras com luz e calculando a média e o desvio padrão de cada contagem de saída de pixel.

SNRρ = (S – D)/σρ

S = intensidade média das amostras (com luz)

D = média do escuro (sem luz)

σ= desvio padrão das amostras (com luz)

ρ = número de pixels

O gráfico completo de SNR versus sinal é um gráfico dos valores calculados de SNRρ (o ruído) versus Sρ – Dρ (o sinal). Isso abrange uma ampla gama de contagens de picos (do escuro ao quase saturado). Como todos os pixels têm a mesma curva de resposta, os dados para o gráfico SNR versus sinal podem vir de todos os diferentes pixels.

Então, qual a relevância do SNR para a minha aplicação? SNR é uma maneira de determinar qual será a incerteza de uma medição individual. Por exemplo, imagine que está a fazer uma medição de irradiação absoluta e deseja saber o brilho (intensidade) de um pico espectral de LED. Se o seu SNR for 100:1, isso significa que tem 1% de incerteza na medição desse pico (o sinal é 100x o ruído).

Outros exemplos de aplicações em que o SNR é importante incluem medições de concentração de absorvância, especialmente quando deseja detetar uma ampla faixa de níveis de concentração do analito de interesse; e aplicações que exigem alta precisão, especialmente, quando o nível de luz incidente no detector é baixo como resultado de baixa refletividade, baixa transmissão ou outros fatores que limitam a luz incidente ou o tempo de integração.

Os utilizadores podem tomar medidas para melhorar o SNR. É possível reduzir o ruído na configuração e/ou adicionar mais sinal: a) aumentando a saída da fonte de luz, b) aumentando o tempo de integração do espectrofotómetro ou c) limitando o espectro da lâmpada de entrada apenas para a área de comprimento de onda de interesse. A última etapa pode ser útil porque aproveita toda a faixa dinâmica do detector nos comprimentos de onda em que é mais importante, pois o sinal tem menos intensidade nos limites do espectro.

Há, no entanto, uma ressalva a fazer. Por várias razões, algumas ou todas essas etapas podem não ser práticas ou podem apresentar compensações indesejadas. Em vez disso, os utilizadores podem melhorar o SNR utilizando a média do sinal. Por exemplo, para a média baseada em tempo realizada em software, o SNR aumentará pela raiz quadrada do número de leituras espectrais usadas. SNR de 300:1, por exemplo, tornar-se-á 3000:1 se for calculada a média de 100 leituras. Para a média baseada espacialmente (média de vagão), o SNR aumentará pela raiz quadrada do número de pixels do detetor em média.

Os métodos de média de sinal são eficazes para aumentar o SNR, mas como a maioria dos fabricantes limita a definição de SNR a uma única leitura, a especificação carece de contexto. Se os fabricantes relatam o SNR como o sinal máximo dividido pelo ruído no tempo mínimo de integração para uma única leitura, qual é o tempo mínimo de integração? E quanta luz foi necessária para atingir esse SNR específico?

Por exemplo, se tiver um espectrofotómetro altamente sensível que pode obter toda a luz necessária num milissegundo, por que não fazer 100 leituras em vez de uma única leitura? Isso aumentaria o SNR em 10x e levaria apenas 100 milissegundos. A menos que esteja a medir um evento transitório, esse tempo de integração seria suficiente para a maioria das aplicações.

Há outra questão a ser considerada: nem todos os fabricantes de espectrofotómetros relatam o SNR utilizando os mesmos critérios. Historicamente, a Ocean Optics especificou o SNR sem aplicar a média de sinal para aumentar a relação, enquanto alguns concorrentes utilizaram a média de sinal para aumentar artificialmente os valores do SNR em espectrofotómetros inferiores.

Por esses motivos, a Ocean Optics começou a relatar o SNR como o SNR máximo por segundo. Este é um parâmetro mais significativo porque fornece uma unidade de medida mais definitiva (ou seja, um segundo versus uma leitura).

Até há pouco tempo, o único método de média de sinal disponível para melhorar o SNR com espectrofotómetros Ocean Optics exigia a média dos espectros no software OceanView no computador principal. Isso limita o número de leituras que se podem obter do dispositivo a cada segundo devido a atrasos no microprocessador e a outras sobrecargas de computação.

O modo de média de alta velocidade (HSAM) é uma nova função nos espectrofotómetros Ocean Optics que oferece aos utilizadores um novo método para melhorar drasticamente o SNR. O HSAM é um recurso de média acelerada por hardware disponível nos espectrofotómetros Ocean ST, SR e HR, e que, para operar, requer o OceanDirect (divers).

O HSAM permite que se execute a média do sinal no próprio espectrofotómetro. Portanto, como não estamos a exportar os dados em cada ciclo (leitura), podemos recolher, significativamente, mais dados no mesmo período em comparação com a média via software. Isso resulta num valor muito maior de SNR por unidade de tempo versus média tradicional

Uma maneira de considerar a média de sinal é esta: se estiver a utilizar a média de sinal e quiser que isso aconteça mais rapidamente, utilize HSAM. Aqui estão dois exemplos em que o HSAM pode adicionar valor:

Primeiro, imagine que está a fazer medições de cores de amostras planas numa correia transportadora, como parte de um processo de controlo de qualidade. As amostras são iluminadas com uma luz muito brilhante, com o objetivo de fazer uma medição de cor refletida nas amostras com certa precisão, o mais rápido possível. Quanto mais rápido você fizer suas medições, melhor será a taxa de execução.

Em segundo lugar, imagine que está a medir mudanças subtis de absorvância numa amostra que é quase transparente e absorve muito pouco. Temos um sinal alto e está à procura de pequenas mudanças na absorvância, então o SNR é um fator limitante. A média do sinal pode ajudar a detectar esses pequenos picos de absorvância, e o HSAM pode obter os dados mais rapidamente, o que permite essa detecção.

Há uma desvantagem com o HSAM: não poderá observar cada espectro. Isto é relevante em medições cinéticas, por exemplo, onde o objetivo é monitorizar mudanças que ocorrem muito repentinamente. Com o HSAM, perderia esses dados, pois fez 100 leituras, por exemplo, e calculou a média delas para uma única leitura. Isso é diferente do nosso exemplo anterior de medição de absorvância, onde precisávamos de um SNR muito alto e precisávamos dos dados rapidamente.

Em última análise, a faixa dinâmica e o SNR oferecem critérios de desempenho importantes na consideração do espectrofotómetro e das opções de configuração espectral. Estes devem ser vistos dentro de um contexto mais amplo que aquilo que estamos a tentar alcançar com as medições e porque é importante não sobrestimar o impacto de qualquer especificação. A sua configuração, na realidade, não é maior do que a soma das suas partes.