Deteção de Níveis Vestigiais de Pesticidas na Casca da Maçã

Os pesticidas desempenham um papel crítico na proteção das culturas alimentares de insetos, fungos, ervas daninhas e outras pragas indesejáveis. O aumento do uso destes pesticidas para manter a produção e a qualidade dos alimentos leva a resíduos potencialmente perigosos que permanecem nos produtos alimentares. Uma técnica rápida e não destrutiva para deteção de pesticidas em partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb) é a espectroscopia Raman Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS). Uma das principais características do SERS é que a utilização de nanoestruturas de metais nobres para aumentar os sinais Raman fracos dos analitos. Apresentamos um novo substrato SERS com nanopartículas de ouro suspensas na água que pode ser usado para ajudar a identificar quatro pesticidas diferentes: tirame, malatião, acetamipride and fosmete.

Para observar as assinaturas espectrais Raman desejadas destes pesticidas, foi esfregada casca de maçã contaminada com cada produto químico e adicionado à suspensão de nanopartículas de ouro, seguindo-se interrogação com excitação a laser de 785 nm. Esta técnica pode detetar cada um destes pesticidas a 1 parte por milhão, quando a tolerância de resíduos de pesticidas em maçãs, conforme estabelecido pelo Código de Regulamentos Federais de 2018 para tirame, malatião, acetamipride e fosmete é de 5 ppm, 8 ppm, 1 ppm e 10 ppm, respetivamente. Os aqui resultados apresentados indicam que o SERS é uma ferramenta útil para identificar resíduos de pesticidas na superfície de frutas para controlo de qualidade e segurança alimentar.

Pesticidas comumente usados, como organofosforados e fungicidas, podem atacar o sistema nervoso central, representando assim um risco para os seres humanos e outros animais após a exposição.¹ Portanto, testes precisos de resíduos de pesticidas são imperativos para minimizar potenciais perigos para a saúde dos seres humanos e da vida selvagem. No entanto, a maioria dos recursos de teste atuais como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia gasosa (GC) acoplados com espectrometria de massa (MS) são caros e demorados.² A espectroscopia Raman oferece certas vantagens sobre GC-MS ou HPLC-MS, como o tamanho reduzido do instrumento, portabilidade para uso em campo, tempos de medição rápidos, amostragem não destrutiva, pouca ou nenhuma preparação de amostra, e implementação simples.^3-6

A espectroscopia Raman é uma técnica de espectroscopia vibracional que fornece informações moleculares sobre o analito de interesse, mas apresenta baixas intensidades de sinal.^3-4 A téncica SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) vem remediar esta grande deficiência introduzindo efeitos de amplificação eletromagnética por excitação localizada de plasmões de superfície. Estas amplificações são exploradas por interações entre metais nobres e moléculas de analitos. Dependendo do tamanho e da forma das nanoestruturas metálicas e do comprimento de onda da luz incidente em medições SERS, a dispersão Raman pode ser aumentada do que 10.000x sua intensidade normal.^6-8 Portanto, SERS permite a deteção a nível vestigial de determinados analitos como pesticidas, onde as tolerâncias de resíduos para os itens alimentares estão geralmente na faixa de ppm a ppb. Além disso, o SERS tem um forte potencial para detetar pesticidas em amostras de alimentos sólidos e líquidos, especialmente para testes de campo após realização de procedimentos de extração simples.²

A otimização dos parâmetros de amostragem permite o alcance de baixos limites de deteção, e a tecnologia continua a avançar para que os sistemas Raman tradicionais possam ser miniaturizados em dispositivos portáteis para uso em campo. Algumas desvantagens do SERS como um método semiquantitativo, de triagem, incluem substratos caros e interferências da matriz.⁶ As melhorias mais significativas SERS são observadas quando o comprimento de onda dos plasmões de superfície do substrato metálico está localizado a até +/- 120 nm do comprimento de onda de excitação do laser e do comprimento de onda da dispersão de fotões.⁹ Normalmente, as nanopartículas de ouro e prata que absorvem na parte visível do espectro são usadas em ensaios SERS com lasers visíveis em comprimentos de onda como 532, 633 e 785 nm, e geralmente resultam no maior aprimoramento de SERS quando em comparação com outros tipos de substratos.^7-8

Vários estudos anteriores relataram deteção vestigial de vários pesticidas utilizando SERS e nanoestruturas de ouro ou prata. Um estudo de Fan et ai. detetou fosmete em 1 ug/g, que é o equivalente a 1 ppm, num extrato de maçã usando SERS e um nanosubstrato de ouro sólido.¹⁰ Outro estudo de deteção vestigial deteta tirame a 11,8 nM (2,8 ppb) usando nanopartículas de ouro em forma de osso de cão e um método SERS de leitura direta em solução. ¹¹ Wong-ek et al. detetou malatião a 90 picogramas utilizando um filme nanorod de prata e SERS.¹² O acetamipride, um neonicotinóide, foi detetado em pepinos usando um substrato de matriz nanorod de prata atingir um limite de deteção de 0,05 ppm,¹³ e Hassan et ai. desenvolveu um óxido de grafeno reduzido e um sensor nanostar de ouro (rGO-NS) para detetar resíduos de acetamipride no chá verde a níveis tão baixos quanto 1,0 x 10-4 mg/mL (0,1 ppm). 14 Imidaclopride, outro neonicotinóide, é um pesticida comumente usado e o principal culpado pelo declínio das populações de abelhas¹⁵; também foi estudado com SERS onde o limite atual de deteção é 0,02 mg.kg^-1 em casca de maçã.¹⁶

Como os estudos acima mencionados demonstram, existem várias formas diferentes de medir resíduos de pesticidas em produtos alimentares usando SERS, seja detetando o pesticida a partir de um extrato,¹⁰ adicionando o pesticida puro diretamente ao substrato SERS,^11-12 ou sondando o pesticida diretamente na superfície da fruta.¹⁶ Neste estudo, em vez disso, utilizamos uma técnica de esfregaço que é não destrutiva ao alimento e tem a potencial para ser uma plataforma de testes para uso em campo. Especificamente, este método de swab é usado para detetar vestígios de pesticidas na casca da maçã, incluindo malatião, fosmete, acetamipride e tirame, a 1 ppm, que é menor ou igual à tolerância estabelecida pelos Estados Unidos no Código de Regulamentos Federais.¹⁷ O método de swab envolve SERS em solução, utilizando nanopartículas de ouro coloidal e uma configuração experimental Raman que envolve laser de excitação a 785 nm e um espectrómetro CCD arrefecido termoelectricamente. são utilizados nanopartículas de ouro coloidal suspensas em água com laser de excitação 785 nm devido à sobreposição espectral da banda de plasmões de superfície da nanopartícula de ouro agregados com o comprimento de onda do laser.¹⁸

Cloreto de ouro hidratado (III) (HAuCl4 · H2O), citrato de sódio dihidrato tribásico (HOC(COONa)(CH2COONa)2 · 2H2O), água TraceSELECT®, acetona, malatião, tirame, acetamipride e fosmete foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Aplicadores Fisherbrand com ponta de algodão (comprimento de 6 polegadas) foram usados ​​para esfregar a pele de maçã. As nanopartículas esféricas de ouro foram sintetizadas de acordo com o método de Lee e Meisel.¹⁹ Resumidamente, 0,8 mL de 0,3 M HAuCl4 foram adicionados a 400 mL de água TraceSELECT® e aquecidos a uma fervura vigorosa. Neste ponto, 120 mg de citrato de sódio em 1 mL de água foram adicionados à solução de ouro; a solução mudou de incolor a roxo-avermelhado em minutos, indicando a formação de nanopartículas de ouro.

Foram preparados soluções de tirame em concentrações de 1 ppm e 10 ppm em acetona, enquanto foram preparados 1 ppm e 10 ppm de malatião, fosmete, e acetamipride em água. As maçãs “Red Delicious” orgânicas foram compradas no supermercado, cuidadosamente enxaguadas com grandes quantidades de água purificada e postas a secar ao ar. Em seguida, a casca da maçã foi cortada numa área de 2,5 cm² e 50 μL do pesticida foi pipetado diretamente no pedaço de casca de maçã e deixado secar completamente. O método de swab envolve pré-umedecer um cotonete com acetona ou água (dependendo do solvente usado para dissolver o pesticida) e arrastar o cotonete pelo pedaço de pele de maçã uniformemente por 30 segundos. O cotonete foi imediatamente adicionado a 1 mL da suspensão de nanopartículas de ouro e deixado por 1 minuto. O swab foi removido antes da recolha do espectro Raman.

O substrato de referência para estas experiências envolveu a adição de 50 μL de acetona ou água a um bocado separado de casca de maçã, deixando-a secar, e, em seguida, esfregando por 30 segundos antes de adicionar o swab às nanopartículas de ouro. Além disso, 50 μL de cada pesticida foram adicionados a 1 mL de nanopartículas de ouro e o resultado dos espectros SERS foram medidos como uma comparação (método de adição direta). Tanto para o cotonete quanto para métodos de adição direta, foram adicionados à mistura 2 μL de 2M HCl de ouro-pesticida para induzir a agregação de nanopartículas, o que cria os hot-spots necessários para otimizar a resposta SERS.^7-8

As experiências Raman foram realizadas usando um Sistema Ocean Insight Raman constituído por um espectrómetro QE Pro, laser de 785 nm e sonda Raman de fibra ótica. A potência do laser foi de 350 mW com 10 segundos de tempo de integração. O tamanho do ponto do laser focado foi de aproximadamente 160 μm. As medidas de absorção foram feitas com um espectrómetro Ocean Insight Flame. Foram adquiridas imagens de microscópio eletrónico de transmissão (TEM) pelo Dr. Emirov na University of South Florida’s Nanotechnology Research & Education Center (NREC). O software ImageJ foi usado para medir o tamanho das nanopartículas de ouro, e pelo menos 200 partículas foram analisadas.

As nanopartículas de ouro usadas neste estudo exibem a ressonância plasmónica de superfície característica (SPR) no pico de absorção a 533 nm (Figura 1A), e são principalmente esféricas com um diâmetro de 40 ± 10 nm com base na análise de imagem TEM (Figura 1B). A posição de pico do SPR é crucial para a técnica SERS ser eficaz, onde deve haver ressonância entre comprimento de onda do laser de excitação, o SPR das nanopartículas e os comprimentos de onda Raman dispersos das moléculas alvo.^8-9 Aqui, a excitação de laser de 785 nm é escolhida porque, mediante a agregação das nanopartículas na presença de pesticidas e HCl, o SPR das nanopartículas muda para comprimentos de onda mais vermelhos.

A técnica de esfregaço de superfície é mostrada em Figura 2, onde o cotonete foi imerso no solvente apropriado, acetona ou água (Figura 2A), antes de ser arrastado pela superfície da amostra por 30 segundos (Figura 2B). Então, o cotonete foi imerso num frasco contendo o nanopartículas de ouro coloidal (Figura 2C) por 1 minuto. O swab foi removido antes da recolha do espectro SERS. O esfregaço mostrado aqui foi realizado numa lâmina de vidro como demonstração da técnica, mas os ensaios deste estudo foi realizado em fatias cortadas de 2,5 cm2 de pele de maçã.

Os pesticidas examinados neste estudo foram tirame, malatião, acetamipride e fosmete. tirame era dissolvido em acetona, enquanto fosmete, acetamipride, e malatião, que foram dissolvidos em água. Os espectros SERS de cada pesticida são apresentados na Figura 3. Os traços pretos, rotulados (i), representam o espectro de referência, que envolveu swabbing de uma superfície de casca de maçã que continha acetona ou água adicionada e imersão do swab na suspensão de nanopartículas de ouro. Os traços vermelhos, rotulados (ii), representam os espectros SERS de um cotonete de casca de maçã com 1 ppm de pesticida adicionado, seguido de imersão do swab na suspensão de nanopartículas de ouro, também conhecido como método de swab. Os traços azuis, rotulados (iii), representam o espectro SERS de 1 ppm de pesticida adicionado diretamente às nanopartículas de ouro, ou o método de adição direta.

O espectro do cotonete de acetona na casca de maçã (Figura 3A, i) exibe picos em 789 cm^-1 (CC₂), 1065 cm^-1 (CH₃), 1229 cm^-1 e 1413 cm^-1 (CH₃), e são consistentes com as bandas Raman características de acetona.²⁰ O espectro SERS para tirame após o método de adição direta é mostrado na Figura 3A (iii), onde um pequeno pico em 356 cm^-1 é atribuído aos à vibração de deformação S=C−S e C−S−S. Outro pico mais fraco em 440 cm^-1 é atribuído à deformação CH₃−N−C e ao C=S. É observado mm pico forte em 554 cm^-1, e é atribuído à vibração S-S. Os modos de vibração, devido ao estiramento de CH₃-N e C=S aparecem como um fraco pico em 931 cm^-1. Por fim, os três picos restantes mais fortes no espectro ocorrem em 1148 cm^-1 (balanço CH₃ e alongamento C−N), 1380 cm^-1 (deformação CH₃ e alongamento C−N), e 1524 cm^-1 (balanço CH₃ e alongamento C−N). Esses picos e as suas atribuições são consistentes com valores da literatura e estão listados na Tabela 1.11.

O espectro SERS do cotonete de pele de maçã com 1 ppm de tirame (Figura 3A, ii) exibe posições de pico semelhantes ao método de adição direta, porém alguns desvios dependendo do modo de vibração observado (Tabela 1). Por exemplo, o pico atribuído à deformação CH₃-N-C e o alongamento C=S parece ligeiramente deslocado para 444 cm^-1, e o balanço CH₃ e alongamento C−N modo agora aparece em 1516 cm^-1. Os outros picos aparecem na mesma posição, e apenas um dos picos não está mais presente ano método de swab 356 cm^-1. Variações da posição espectral e intensidade de bandas Raman em ensaios SERS podem ser devido a vários fatores, incluindo a variação entre o estado de agregação de nanopartículas.²¹ A ausência de certos picos no método de swab também ocorre com alguns dos outros pesticidas examinados neste estudo e também e será anotado abaixo.

Na Figura 3B, são exibidos os espectros SERS de (i) uma água swab, (ii) um swab de malatião de 1 ppm e (iii) adição direta de 1 ppm de malatião. Para malatião adicionado diretamente à suspensão de nanopartículas de ouro, o pico em 509 cm^-1 é atribuído à vibração P-S e o pico em 621 cm^-1 é atribuído ao alongamento P=S. Outras vibrações de alongamento têm picos que aparecem em 826 cm^-1, 1015 cm^-1, 1126 cm^-1 e 1721 cm-1, que são atribuídos a C–O–C, P–O–CH₃, C–C e C=O, respetivamente. O pico em 1154 cm^-1 é atribuído ao alongamento CH₂, e o pico em 1371 cm^-1 é devido ao alongamento de CH₃. Por fim, o pico em 1456 cm^-1 é atribuído à deformação CH₂ e CH₃. As posições de pico SERS e atribuições para malatião detectadas por ambos os métodos, de swab e de adição direta, estão listados na Tabela 1 e assemelham-se aos valores relatados na literatura.^12,22 As posições dos picos para o swab de malatião são ligeiramente deslocados em comparação com as posições dos picos do método de adição direta, e ocorrem a 501 cm^-1, 629 cm^-1, 813 cm^-1, 1018 cm^-1, 1107 cm^-1, 1148 cm^-1, 1368 cm^-1, 1458 cm^-1 e 1724 cm^-1. Estes picos têm as mesmas atribuições mencionadas acima para a adição direta de malatião.

Na Figura 3C, são mostrados os espectros SERS de (i) um swab de casca de maçã com água, (ii) um swab de casca de maçã com 1 ppm de acetamipride e (iii) 1 ppm de acetamipride adicionado diretamente à suspensão de nanopartículas de ouro. As posições e atribuições dos picos SERS para (ii) e (iii) estão listadas na Tabela 1 e são semelhantes aos valores relatados na literatura para o acetamipride. ^13-14 O pico em 512 cm^-1 é atribuído à vibração de balanço H−C−H. Os picos em 576 cm^-1, 631 cm^-1 e 728 cm^-1 são atribuídos à vibração de N−C=N, C−C−C, C−H modos, respetivamente. O pico que aparece em 960 cm^-1 deve-se à vibração de deformação C−C−N. Modos de vibração de N-C e C-C estão localizados em 1110 cm^-1 e 1287 cm^-1, respetivamente. Por fim, o pico em 1347 cm^-1 é devido ao H-C-H assimétrico e o pico em 1591 cm^-1 é atribuído à respiração do anel.

Tabela 1. Correspondências dos picos Raman para os pesticidas examinados neste estudo (ν: stretching, ρ:rocking, δ: deformation, ω: wagging, s: symmetric, as: antisymmetric)

A maioria dos picos de acetamipride que estão presentes no método de adição direta aparecem no espectro do swab de casca de maçã. Alguns dos picos são ligeiramente deslocados, mas têm as mesmas atribuições e aparecem em 576 cm^-1, 631 cm^-1, 1110 cm^-1, 1287 cm^-1, 1347 cm^-1 e 1594 cm^-1. A vibração H-C-H (512 cm^-1), C-H (728 cm^-1) e deformação C−C−N (960 cm^-1) não são visíveis para a amostra de swab. A ausência destes picos pode dever-se a motivos como os responsáveis ​​pelo anteriormente deslocamento espectral observado e variações na intensidade do sinal SERS. Uma explicação adicional pode envolver a eficiência do método de swab. Em geral, as intensidades de SERS para os agrotóxicos que foram esfregados são menores em comparação com os métodos de adição direta. Talvez o método do cotonete não recolha a mesma quantidade de pesticida que é adicionado durante o método da adição direta. Para superar isto, pode ser necessária a otimização do método, ou um tempo de integração mais longo e média espectral.

A Figura 3D mostra os espectros SERS de (i) um cotonete de casca de maçã com água, (ii) cotonete de casca de maçã contendo 1 ppm de fosmete, e (iii) 1 ppm phosmet adicionado diretamente a uma solução de nanopartículas de ouro. As posições de pico e atribuições correspondentes a (ii) e (iii) para fosmete são exibidas na Tabela 1 e correspondem ao relatado na literatura.¹⁰ Para a amostra onde o fosmete foi adicionado diretamente à suspensão de nanopartículas de ouro, o pico em 498 cm^-1 é atribuído à vibração CH₂ e PO₂. A deformação C=O e P=S para fosmete aparecem em 608 cm^-1 e 670 cm^-1, respetivamente. O pico em 711 cm^-1 é atribuído à respiração do anel de benzeno. O forte pico localizado em 779 cm^-1 é atribuído ao estiramento P–O e à deformação CH₃. O pico em 908 cm^-1 é atribuído à vibração assimétrica de C−N. A vibração P–O–C é indicada pelo pico em 1015 cm^-1. A vibração de C−N aparece em 1069 cm^-1. Os picos em 1194 cm^-1, 1300 cm^-1, 1377 cm^-1 e 1608 cm^-1 são atribuídos à deformação C–N, C–C, CH₃ e alongamento C=C, respetivamente. Os picos em 1255 cm^-1 e 1409 cm^-1 são atribuídos ao alongamento C-N e à deformação C-H em S–CH₂–N, respetivamente. Finalmente, ambos os picos em 1707 cm^-1 e 1772 cm^-1 são atribuídos à vibração C=O.

A maioria dos picos para o swab de fosmete (ii) ocorre em posições semelhantes para a amostra com fosmete adicionada diretamente às nanopartículas de ouro (iii). O único pico que é ligeiramente deslocado é para o modo vibracional de deformação P=S, que está localizado a 673 cm^-1 no swab, mas aparece mais próximo de 670 cm^-1 com o método de adição direta. Além disso, existem alguns picos que estão presentes na adição direta de fosmete e não aparecem no espectro de swab: 908 cm^-1, 1069 cm^-1, 1300 cm^-1, 1608 cm^-1 e 1707 cm^-1. No entanto, as intensidades destes picos são relativamente baixas para a adição direta de fosmete, e é provável que não apareçam no espectro do swab uma vez que a intensidade dos dados de swab é geralmente menor em comparação à adição direta de pesticidas.

Neste estudo, é apresentada uma técnica de swabbing não destrutiva ao item alimentar e tem o potencial de ser uma plataforma de testes para uso em campo. O método de swab utiliza nanopartículas de ouro para detetar níveis vestigiais de vários pesticidas incluindo tirame, malatião, acetamipride e fosmete na casca da maçã. Esta técnica pode detetar cada um destes pesticidas até 1 ppm, quando as tolerâncias de resíduos de pesticidas em maçãs, conforme estabelecido pelo Code of Federal Regulations 2018 são 5 ppm, 8 ppm, 1 ppm e 10 ppm para tirame, malatião, acetamipride e fosmete, respetivamente. As medições Raman foram feitas utilizando um espectrómetro Raman económico com laser de excitação 785 nm e tempos de recolha rápidos, sendo nenhum superior a 10 segundos. Embora alguns picos não estejam presentes ao comparar o método de swab ao método de adição direta de agrotóxicos às nanopartículas, os principais picos dos pesticidas são visíveis em intensidade suficiente para indicar a presença de resíduos de pesticidas na casca da maçã. Os próximos passos envolverão testar uma mistura de pesticidas aplicada à superfície dos alimentos para ver se o método de swabbing acoplado ao método SERS pode distinguir mais de um pesticida. Os resultados aqui apresentados indicam que o SERS juntamente com o método de swab é representa uma ferramenta valiosa e tem um potencial significativo para identificar resíduos de pesticidas na superfície de frutas e para controlo qualidade e segurança alimentar.

1. Stoytcheva, M., [Pesticides – The Impacts of Pesticide Exposure], InTech, Rijeka, Croatia, 30-48 (2011).
2. Xu, M.L., Gao, Y., Han, X.X. and Zhao, B., “Detection of pesticide residues in food using surface-enhanced Raman spectroscopy: a review,” J. Agric. Food Chem. 65, 6719-6726 (2017).
3. Ellis, D.I., Muhamadali, H., Haughey, S.A., Elliott, C.T. and Goodacre, R., “Point-and-shoot: rapid quantitative detection methods for on-site food fraud analysis – moving out of the laboratory and into the food supply chain,” Anal. Methods 7, 9401-9414 (2015).
4. Craig, A.P., Franca, A.S. and Irudayaraj, J., “Surface-enhanced Raman spectroscopy applied to food safety,” Annu. Rev. Food Sci. Technol. 4, 369-380 (2013).
5. Cordella, C., Moussa, I., Martel, A., Sbirrazzuoli, N. and Lizzani- Cuvelier, L., “Recent developments in food characterization and adulteration detection: technique-oriented perspectives,” J. Agric. Food Chem. 50, 1751-1764 (2002).
6. Zheng, J. and He, L., “Surface‐enhanced Raman spectroscopy for the chemical analysis of food,” Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 13, 317-328 (2013).
7. Haynes, C.L., McFarland, A.D. and Van Duyne, R.P., “Surface enhanced Raman spectroscopy,” Anal. Chem. 77, 338A-346A (2005).
8. Sharma, B., Frontiera, R.R., Henry, A., Ringe, E. and Van Duyne, R.P., “SERS: materials, applications, and the future,” Mater. Today 15(1,2), 16-25 (2012).
9. Haynes, C.L. and Van Duyne, R.P., “Plasmon-sampled surface- enhanced Raman excitation spectroscopy,” J. Phys. Chem. B 107(30), 7426-7433 (2003).
10. Fan, Y., Lai, K., Rasco, B.A. and Huang, Y., “Analyses of phosmet residues in apples with surface-enhanced Raman spectroscopy,” Food Control 37, 153-157 (2014).