Espectroscopia para Deteção de Vírus a Níveis Vestigiais
por Derek Guenther, Senior Application Scientist
Nesta visão geral, exploramos as ferramentas de deteção ótica e técnicas disponíveis da Ocean Insight para deteção de vírus. O nosso foco? Teste rápido e triagem de vírus, incluindo COVID-19.
A COVID-19 colocou-nos a todos numa luta única, não contra um exército físico ou uma ideia intangível, mas contra um novo vírus que ataca pessoas de todas as nações, especialmente os nossos cidadãos mais vulneráveis. Mas temos vários caminhos para lutar, incluindo:
- Distanciar. Ao minimizar a interação pessoa a pessoa, também se minimizam potenciais transmissões.
- Vacinas. Com uma vacina bem projetada, mesmo que alguém tenha fique exposto ao vírus, as suas hipóteses de este se transformar numa infeção notável pode ser bastante reduzida.
- Tratamentos. Se alguém for exposto ao vírus e este se transformar numa infeção, uma panóplia eficaz de tratamentos pode ajudar a minimizar as taxas de mortalidade e a gravidade geral da doença.
- Deteção e rastreamento. Estes são os nossos olhos na batalha contra um inimigo invisível e as principais ferramentas que examinaremos aqui.
As etapas de deteção e rastreamento são críticas para entender como a propagação do vírus ocorre historicamente, para que a propagação futura pode ser minimizada. Isto permite que consideremos as atividades e cenários que acarretam o maior risco e identifiquemos os mais vulneráveis. Quando sabemos como e onde está a ocorrer transmissão podemos calibrar as nossas políticas e ações.
Mas enquanto os métodos de deteção lentos podem servir para este propósito de forma razoável, as técnicas deteção rápida aproximam-nos ainda mais de um retorno às rotinas normais. Um sistema de teste rápido implantado à entrada de um estádio, escola, aeroporto ou centro de enfermagem pode evitar instantaneamente um cenário extremo de propagação de que ouvimos falar com demasiada frequência.
O método testado e comprovado de deteção viral baseia-se em tecnologia PCR revolucionária, ou reação em cadeia da polimerase. Esta abordagem usa enzimas polimerase para replicar ou amplificar uma região específica de material genético, se houver. Podem ser concebidos modelos que visam ampliarespecificamente partes do código genético COVID-19; se esses segmentos de código estiverem presentes, eles serão amplificados. Esta amplificação requer ciclo térmico por aproximadamente 30-40 ciclos, que normalmente é a parte mais demorada da técnica de PCR.
Quando o ciclo térmico está completo, existem vários métodos para observar se a genética alvo está presente na amostra. É aqui que aplicar conhecimento espectral pode ajudar a moldar a deteção de vírus.
Fluoróforos comuns, como a fluoresceína e os seus derivados, podem ser complexadas para que se tornem fluorescentes apenas quando ligados ao segmento genético alvo, COVID-19. Com estas únicas ferramentas fluorescentes na mão, o próximo obstáculo que enfrentamos em nosso esforço para diminuir o tempo de teste e aumentar a sensibilidade do teste está na otimização da deteção de fluorescência.
A abordagem mais comum para este tipo de fluorescência a níveis vestigiais é a espectroscopia de banda larga em estado estacionário, que é bem servida pelo espectrómetro Ocean HDX (Figura 1) e LED LSM kits. O Ocean HDX define um novo padrão para o desempenho com pouca luz numa pegada incrivelmente compacta. Com um defletor interno e outro trunfos de design ótico, o Ocean HDX permite deteção de fluorescência em níveis anteriormente atingíveis apenas com sistemas muito maiores e mais caros. Detetar esta fluorescência vestigial é uma das opções de LED LSM da Ocean Insight, fornecendo excitações de estáveis e alta potência para limpeza e coerência dos sinais de emissão (Figura 2).
A abordagem tradicional de espectroscopia de banda larga traz consigo uma série de vantagens, incluindo a capacidade de observar várias espécies fluorescentes ao mesmo tempo com um só dispositivo, e a capacidade de desenvolver métodos numéricos complexos para destacar sinais desejados das tendências de banda larga.
Mas há outra forma de observar esse sinal de fluorescência, usando uma abordagem que explora as propriedades de decaimento rápido de corantes fluorescentes ao longo do tempo. A Ocean Insight fornece o sistema de fluorimetria de fase NeoFox como uma plataforma de sensor ótico de oxigênio (Figura 3), uma vez que também desenvolve o sensor de oxigénio responsivo, a sonda de suporte e outros componentes que compõem a plataforma.
Mas o NeoFox também é popular por se poder incorporar em outros dispositivos, com modificações em LEDs, filtros, e configurações internas para otimizar o sistema numa plataforma de deteção personalizada. Ao configurar o LED como uma onda quadrada em velocidades de kHz, o detetor ultrassensível de fotodíodo NeoFox vê o sinal de fluorescência crescer durante o tempo on do LED, mas também decai durante o tempo de desligamento do LED. Este tempo de decaimento é observado numa escala de micro a nanossegundo e pode ser fortemente correlacionado com a concentração de fluoróforo no fluido de teste, como como uma pequena amostra de PCR. Os benefícios desta abordagem incluem hardware simplificado, já que o NeoFox contém toda a sua ótica e eletrónica de processamento num único invólucro, e fornece boa imunidade a interferências e a variáveis como a cor da amostra e luz ambiente.
Embora o PCR tenha feito maravilhas no avanço do mundo da genética, ainda há restrições de tempo do ciclo térmico a considerar. A Ocean Insight oferece ainda outra abordagem, com o potencial para oferecer respostas imediatas de deteção viral em segundos e sem qualquer pré-processamento de amostra. Esta abordagem explora a técnica Raman, que usa um laser para conduzir fenómenos de dispersão Raman observáveis.
Raman é uma técnica de identificação rápida e poderosa baseada na rara interação de fotões com a estrutura molecular da amostra, especificamente olhando para o aumento ou diminuição do nível de energia dos fotões em quantidades quantizadas. Estes sinais de emissão afiados são “impressões digitais” inerentes a um analito e pode dizer-se rapidamente quando uma determinada espécie está presente. A Ocean Insight oferece sistemas Raman de alto desempenho com várias opções de comprimento de onda, como a plataforma QE-Pro Raman+ altamente popular e oferecida em configurações de 785 nm, 638 nm e 532 nm. Adicionandar o laser e a sonda apropriados ao comprimento de onda são tudo que é necessário para medições Raman básicas.
Para deteção a nível vestigial, as emissões Raman podem ser ainda mais amplificadas pela utilização de certos metais que estão ‘em sintonia’ com a frequência do laser, apoiando-se num efeito chamado SPR (Surface Plasmon Resonance). Ao utilizar nanopartículas ou nanoestruturas de um metal como ouro ou prata, os analitos podem estar próximos a este efeito SPR e levar a uma amplificação dramática de fotões de emissão Raman, que é uma técnica chamado SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy). A Ocean Insight tem sido uma empresa líder em SERS desde 2014 e oferece substratos consumíveis de baixo custo num formato fácil de utilizar (Figura 4). Estes convenientes pacotes de 5 unidades têm uma combinação própria de nanopartículas embutida numa matriz de quartzo e incorporadas numa lâmina de vidro padrão de microscópio. O utilizador pode simplesmente adicionar alguns microlitros de amostra à região dopada com nanopartículas e colocar a amostra sob a sonda Raman para uma deteção rápida de analitos vestigiais.
A Ocean Insight trabalhou com vários investigadores incluindo Botanisol Analytics (https://bsol.io/) que estão a utilizar Raman para deteção rápida de COVID-19.
Mesmo as varreduras preliminares com componentes comerciais têm mostrado atividades Raman repetíveis tanto para fragmentos de vírus direto como para os respetivos anticorpos (Figura 5). Estas medições foram feitas em fluidos de amostra bastante limpos quando comparados com amostras clínicas obtidas pelo paciente. Ainda assim a investigação estabelece as regiões de atividade Raman onde procurar para verificar um fluido “mais sujo” do mundo real. Quando se analisa com o Ocean Intelligence, a plataforma avançada de machine learning espectral da Ocean Insight, varreduras de biofluidos complexos podem ser completa e rapidamente decifrados para fornecer um resultado positivo/negativo com alta confiança estatística.
Como em qualquer desenvolvimento, o progresso é tão bom quanto os parceiros que se encontram e os recursos se disponibilizam. A Ocean Insight traz um nível de especialização em hardware espectral, técnicas para usar com esse hardware, e a visão para alcançar o que não foi feito antes. Se está na luta para avançar dramaticamente a deteção viral para ajudar o mundo a subjugar pandemia do COVID-19, estamos ansiosos para conhecer a sua visão e como o nosso conhecimento espectral aplicado pode ajudar a desbloquear o possível.